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          显微镜小百科 - 用显微镜多年,你调过柯勒照明吗?

          在任何特定光学显微镜设置中,柯勒照明技术都是实现zui佳成像的zui重要、zui基本的技术之一。正确调节柯勒照明后,可以确保均匀的反差和照明、较高的分辨率以及更多细节,从而大幅改善图像的质量。

          尽管这项技术属于设置显微镜的常规内容,但这项技术目前仍未在显微镜工作者中获得广泛实施。实际上,了解两个主要显微镜部件(视场光阑和聚光镜)后,完成正确设置就只是几分钟的事情了。

          本文介绍了柯勒照明的主要原理,以及如何通过五个简单步骤来进行调整。 

           

          August Koehler(1866-1948)

          August Koehler于 1893 年发表了他发明的照明方法后,这项“柯勒照明”技术就以其名字予以命名了。柯勒的照明方法发表时,大多数显微镜都借助镜子和煤气灯作为照明光源。再加上显微照相术,研究人员一度使用需要长时间曝光的乳胶板,这通常会导致成像的不一致性。

           

          重要原理

          即使今天,柯勒的均匀照明技术仍然被广泛使用,并构成了共聚焦相差以及微分干涉相差 (DIC) 显微术等众多技术的基础。一旦您了解如何使用正确的柯勒照明来设置显微镜后,完成设置仅需不到一分钟的时间,却为成像效果带来极大改善:这样能够确保光源均匀照射样本,使图像更清晰,并提高染色区域之间以及切片组织区域之间的反差。

          如果您要在 PPT 演示、海报展示中使用图像,或要将图像提交给某家杂志,那么,柯勒照明是必须的。这个简单的“五步走”技术将对您大有裨益。

          在您实现柯勒照明过程中,除了显微镜物镜之外,还需要注意并调节另外两个部件。

          视场光阑

          “视场光阑”作为显微镜主体的一部分,通常位于底座(正置显微镜)之中,参见图 1。视场光阑仅用于控制zui终到达载物台上载玻片的光量。控制光源发出的光量,即可减少由光源引发的眩光,从而确保图像拥有更好的反差。

           

          图 1:正置显微镜的主要部件。视场光阑用于控制来自光源的光强。聚光镜用于将光源发出的光聚焦在样本上。孔径光阑用于控制照明光锥。

          聚光镜

          聚光镜位于正置显微镜载物台的正下方。在倒置显微镜中,则位于载物台之上、光源和视场光阑的前面,如图 1 所示。尽管聚光镜配备调焦旋钮,与显微镜的细调焦/粗调焦相似,但这个部件主要用于聚焦光源/视场光阑发出的光线,并不会对样本进行聚焦。 

          “聚光镜”用于收集光源的大部分光线,并将其作为成像光射线的光锥聚焦于显微镜载物台的载玻片之上。准确调整该聚光镜后,即可优化对样本的照明效果和进入物镜的光线。这样就确保了zui终图像的均匀光强和反差。由于每个显微镜的物镜都不同,这就意味着更改放大倍率时,应对聚光镜予以调节。

          聚光镜中含两个主要部件,您可以在设置正确柯勒照明的过程中,对这两个部件进行调节。这两个部件为:调中螺丝和光阑。与视场光阑一样,聚光镜也有一个控制光量的光阑。该光阑用于控制对样本进行照明的光锥角度。整个显微镜系统的数值孔径不仅仅是由物镜决定的。当聚光镜光阑打开时,整个仪器的数值孔径会提高,使得分辨率和反差更佳且能够实现zui优照明效果。调中螺丝能够确保用于照明载玻片的光线直接射入视场角的中心,因而保证了样本周围的均匀光强。

          柯勒照明的五个步骤

          第 1 步:

          开始成像之前,请务必检查透镜、目镜和物镜是否干净。将载玻片放在载物台上,打开灯,并将其调至zui低设定值。 

          第 2 步:

          对样本进行聚焦。首先,关小位于正置显微镜底座或倒置显微镜聚光镜之上的视场光阑。俯身查看目镜时,您刚好能看到载玻片上的小光圈,参见图 2。

           

                                                  图 2:关闭视场光阑。

          第 3 步:

          对聚光镜进行调焦。当您坐在显微镜前时,调节聚光镜的旋钮通常位于调焦旋钮的正前方。当您俯身查看目镜时,缓慢地上下移动聚光镜。此时,您将看到光圈的边缘处于聚焦和未聚焦状态,而且,光圈将从红色条纹变成蓝色条纹。尽可能将光圈的边缘调节至zui清晰状态,参见图 3。

           

           图 3:对聚光镜进行调焦。

          第 4 步:

          一旦光圈清晰后,请将目光从目镜上移开,并查看显微镜的聚光镜部件。此时,您将看到调中螺丝。握住螺丝时,再次俯身查看目镜。缓慢拧动螺丝时,您会看到光圈在视场中移动。您应该将光圈移动至样本视场中间位置,参见图 4。

           

             图 4:对聚光镜进行调中。

          对聚光镜进行调中后,打开视场光阑直至光圈边缘正好消失,参见图 5。 

           

          图 5:打开视场光阑。

          第 5 步:

          采用可变(或孔径)光阑完成zui终调整。在调中螺丝正下方(倒置显微镜则位于上方),您会发现与视场光阑相似的另外一个光阑。当您俯身查看目镜时,将其完全打开,然后逐渐关小该光阑,直至图像眩光消失。关闭光阑时,样本的反差将提高,而分辨率却会降低。

          以上就是实现柯勒照明的五个步骤了。

          总而言之,这五个步骤就是:关小视场光阑对边缘进行调焦调中光斑开大光阑减少眩光

           

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